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Una coltura cellulare è costituita da un gruppo omogeneo di cellule eucariote provenienti da tessuti animali; le colture sono mantenute in vita per tempi anche molto lunghi, usando condizioni sperimentali appropriate.
Ottenere colture cellulari partendo dai tessuti degli organismi superiori è un’operazione
complessa, dato che tali tessuti sono eterogenei (cioè presentano tipi cellulari diversi tra
loro).
Generalmente i protocolli di isolamento prevedono una prima fase il cui scopo è quello di
saparare i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice extracellulare e le
giunzioni intercellulari che le mantengono unite. A tale scopo il tessuto viene incubato con
enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi) dissociando le singole cellule mediante
tecniche meccaniche. Alla fase di dissociazione segue la fase di separazione; per separare i
vari tipi cellulari da una sospensione cellulare mista si può procedere in vari modi:
1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole a
bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che
possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità;
2. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di
vetro o di plastica;
3. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi
separando le cellule marcate da quelle non marcate;
4. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi
cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o
inibiscono) la crescita di determinati tipi cellulari.
La sospensione cellulare omogenea così ottenuta è messa in “coltura”, cioè viene trasferita
in contenitori appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie
al sostentamento delle cellule.
Le cellule crescono adese o in sospensione. Le cellule che crescono adese al supporto su
cui sono state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se
sono sane, in quanto risentono dell’inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e
quindi non risentono dell’inibizione da contatto). Le cellule in sospensione non crescono
adese alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun
supporto.
COLTURA PRIMARIA: coltura preparata a partire dai tessuti di un organismo eucariote.
COLTURA SECONDARIA: coltura propagata a partire dalle colture primarie;
COLTURA CONTINUA O IMMORTALE
(più facili da coltivare, instabili geneticamente,
possono essere diverse dalle cellule di origine)
CELLULE DI LINEA: gruppi di cellule morfologicamente uniformi che possono essere
propagate in vitro per un tempo indefinito;
COLTURE NEOPLASTICHE
(elevata capacità di riproduzione, molto simili
alle cellule da cui originano)
CLONE: popolazione proveniente da un’unica cellula progenitrice.
TERRENI DI COLTURA
Il terreno di coltura viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze del tipo cellulare
utilizzato. Può essere liquido (pronto all’uso) oppure in polvere (in tal caso deve essere
ricostituito come indicato dalla casa produttrice).
In ogni caso il terreno di coltura deve avere le seguenti caratteristiche:
Deve avere determinati valori di pH e osmolarità;
Deve essere non tossico;
Deve contenere tutti i composti necessari al metabolismo cellulare, e precisamente:
Ioni, per mantenere il bilancio osmotico;
Zuccheri, come fonte di energia;
Amminoacidi, per la formazione di proteine;
Vitamine, cofattori enzimatici.
Il terreno di coltura può contenere anche Rosso Fenolo, quale indicatore di pH.
Prima dell’uso al terreno di coltura vengono aggiunti una miscela di antibiotici (di solito
penicillina/streptomicina) e un antimicotico (generalmente anfotericina B).
Un problema che ha reso difficili i tentativi pionieristici di mantenimento di colture e
complica la vita quotidiana dei biologi cellulari è la sterilità: i terreni di coltura ed il siero
sono infatti molto "appetibili" per batteri, lieviti e funghi che possono facilmente inquinare
le colture cellulari. Questo problema viene affrontato a vari livelli:
1. Tutte le manipolazioni delle colture cellulari vengono fatte in cappe a flusso
laminare provviste di filtri, che limitano la contaminazione occasionale con
microrganismi trasportati dall'aria.
2. Tutti i materiali utilizzati per la manipolazione (pipette, piastre da coltura) sono
sterili e di norma monouso.
3. Ai terreni di coltura vengono spesso aggiunti antibiotici per limitare la possibilità di
inquinamento da parte dei più comuni batteri.