La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente in vitro.

 

 

Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di sequenza. È necessario che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, e che una piccola quantità della sequenza sia disponibile per dare inizio alla reazione. Non è necessario che la sequenza da sintetizzare enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; essa può anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa, come un segmento di un gene a singola copia nel DNA totale umano. La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle 5' degli oligomeri utilizzati.

 

Un tipico ciclo di PCR prevede:
1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che deve essere copiato (94 - 99 °C)
2. Appaiamento (annealing) di coppie di oligo, a temperatura ideale di circa 52° (30 - 65 °C)
3. Estensione (Elongation) da parte di DNA polimerasi termoresistente a partire dai primer. (65 - 72 °C)
La scelta delle condizioni operative del ciclo (tempo e temperatura) è compito dell'operatore, è una scelta empirica e non prefissata.
Un passaggio graduale tra la temperatura di annealing e la temperatura di estensione permette alla Taq di iniziare l'estensione senza che i primers si stacchino. Via via che la Taq polimerizza la Temperatura supera i 72 °C e rincomincia il ciclo con la denaturazione.

 

Durante il primo ed ogni successivo ciclo di reazione, l'estensione di ogni oligonucleotide sullo stampo originale produrrà una nuova molecola di ssDNA di lunghezza indefinita. I filamenti originati, in questo modo, fungeranno da stampi per l'uno o l'altro degli oligonucleotidi durante i cicli successivi, e l'estensione di questi oligonucleotidi dalla polimerasi produrrà molecole di una lunghezza definita, corrispondente a quella della sostanza di interesse. Queste molecole fungeranno anch'esse come stampi per l'uno o per l'altro oligonucleotide producendo altre molecole di grandezza definita. In questo modo si svilupperà una reazione a catena che porterà all'accumulo di uno specifico dsDNA in maniera esponenziale rispetto al numero di cicli di reazione. Il grado di amplificazione finale è dato da 2^(n-2) dato che i primi due cicli sono nulli.

Applicazioni

 

Indagini di polizia scientifica.
Riconoscimenti di paternità.
Diagnosi di malattie genetiche.
Diagnosi di traslocazioni cromosomiche associate ad insorgenza di forme tumorali.
La PCR è comoda perché, grazie al suo alto potere amplificatorio, ci permette di individuare il male anche nella fase precoce della neoplasia, come ad esempio in una leucemia.

Normalmente nel genoma abbiamo assetti cromosomici ben definiti, ma si vede che alcune porzioni hanno alta tendenza a rompersi e a riarrangiarsi, causando espressione non regolata di alcuni geni, da cui il tumore.