Il blotting rappresenta una metodica di laboratorio per eseguire l’ibridazione di frammenti di acidi nucleici con una sonda o probe. Presuppone che l’acido nucleico da analizzare sia già stato frammentato da enzimi di restrizione, clonato e amplificato, ad esempio con la PCR, e separato nelle frazioni costituenti impiegando l’elettroforesi.

E' usato per determinare la presenza, l'assenza o la mutazione di particolari sequenze geniche e per studiare la struttura e l'organizzazione di un gene.

In inglese blot significa asciugare con carta assorbente, e fa riferimento alla fase finale della metodica, quando viene impiegata una pila di carta da filtro asciutta.

 

 

 

Il Southern blot è un saggio mediante il quale si può osservare la presenza o l'assenza di specifici frammenti genici. Fu messo a punto nel 1975 da Sir Edwin Mellor Southern e da allora ha rivoluzionato l'approccio dei biologi molecolari nei confronti della ricerca di sequenze specifiche di informazione genetica nel patrimonio genetico di animali, virus e batteri.

In questa tecnica cromatografica un campione eterogeneo di dna genomico viene trattato con enzimi di restrizione e successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel d'agarosio o di poliacrilammide. Sul gel si troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso molecolare. Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA.

I frammenti di DNA sono poi trasferiti, o assorbiti, su un filtro di nitrocellulosa sul quale restano immobilizzati nelle relative posizioni. Successivamente vengono aggiunte sonde geniche specifiche marcate con radioisotopi che ibridizzano coi frammenti complementari presenti sul filtro, successivamente rivelati da un’autoradiografia.

 

 

gel	blot
autoradiografia

 

 

Una tecnica simile, impiegata per analizzare frammenti di RNA, è detta per analogia Northern blot.
La tecnica del Northern blotting è del tutto analoga a quella precedentente descritta del Southern blotting. Dal punto di vista tecnico i Northern blots sono più difficili per la considerevole propensione dell RNA a degradarsi. Per evitarlo bisogna osservare molte precauzioni, lavorare in ambienti ragionevolmente privi di RNasi ed utilizzare inibitori delle RNasi. Contrariamente a quello che si potrebbe credere anche gli RNA vanno denaturati per liberarli da strutture secondarie molto stabili. A questo scopo gli RNA vengono fatti correre su gel di agarosio denaturanti.

Il Western blot è una tecnica che permette di valutare quanto sia espressa una proteina e dove sia localizzata. Similmente a Northern e Southern, sfrutta prima una elettroforesi denaturante (SDS-Page) per far separare le varie proteine in funzione della massa, annullando le cariche degli amminoacidi che influenzerebbero la migrazione.
Viene poi visualizzata attraverso anticorpi radioattivi creati per la proteina di interesse: in particolar modo si ottengono iniettando in topo/ratto/coniglio la proteina, per poi estrarre gli anticorpi prodotti come reazione immunologica. Spesso si usano più anticorpi: l'anticorpo primario è riferito e diretto alla proteina di interesse, uno o più anticopri secondari, si legano a quello primario perchè di origine diversa (prodotto da un animale di specie diversa, come topo e coniglio), amplificando così la radioattività a questi anticorpi associata.