I vettori da utilizzare per il clonaggio vengono scelti in base ad una serie di criteri. Innanzi tutto si valuta la loro capacità di accogliere DNA esogeno di grandi dimensioni (capacità di inserzione) e la facilità di manipolazione richiesta per la preparazione al clonaggio. Il clonaggio di inserti più lunghi di 5-10kb aumenta a tal punto le dimensioni del plasmide da rendere poco efficiente la trasformazione di ospiti batterici. Per il clonaggio di inserti molto lunghi, perciò, sono stati adattati a vettori dei batteriofagi (o fagi) cioè dei virus batterici.

Molto comune è l’impiego di derivati del batteriofago λ: l’efficienza di clonaggio con questi è 16 volte superiore rispetto ai vettori plasmidici. Inoltre si possono usare altri vettori ad alta capacità, come cromosomi artificiali di lievito (YAC), cromosomi artificiali batterici (BAC) e cromosomi artificiali derivati da P1 (PAC). Tutti questi hanno il vantaggio di poter contenere inserti di DNA di dimensioni notevolmente superiori ai batteriofago λ.

Plasmidi

Sono composti da DNA extracromosomiale circolare, che può a volte integrarsi nel cromosoma principale assumendo il nome di episoma.

I plasmidi variano in dimensione, ma la maggior parte va dalle 1.000 alle 25.000 paia di basi (in genere una decina di geni). Replicano autonomamente dal cromosoma genomico, grazie alla presenza di una sequenza ORI . Spesso ci sono molte copie plasmidiche in ogni cellula. Inoltre una cellula può contenere più tipi differenti di plasmidi o può non contenerne affatto. Generalmente trasportano geni non essenziali per la sopravvivenza della cellula eccetto speciali circostanze. Per esempio, molti plasmidi portano geni per la resistenza ad antibiotici. Alcuni la portano per più antibiotici, rendendoli pericolosi patogeni. In altri casi possono portare i geni della virulenza che aumentano la capacità della cellula di infettare un ospite. Una malattia basata su un plasmide di recente interesse è causata dall’E.Coli 0157:H7. Sono molto usati come vettori.

Cosmidi

Sono stati i primi vettori a grande capacità utilizzati in progetti di sequenziamento (1992). I cosmidi sono ibridi tra plasmidi (replicone, resistenza ad antibiotici) e fago λ (estremità cos). La sequenza cos permette l'impacchettamento del DNA. La capacità massima degli inserti è pari a 45 Kb.

I cosmidi portano la versione modificata del replicone colE1 dei plasmidi. Le molte copie presenti nella cellula ospite favoriscono l’insorgere di delezioni, perché le sequenze di cosmidi diversi possono ricombinare tra loro. I cloni con delezioni spesso prendono il sopravvento nella popolazione perché si dividono più rapidamente.

Batteriofagi

Durante la trasduzione specializzata, Il Fago Lambda si comporta come un vettore, anche se la ricombinazione non avviene in provetta ma nella cellula. Lambda può anche essere utilizzato come vettore di clonaggio per la ricombinazione in vitro. E` un vettore particolarmente utile poiché è ben conosciuto da un punto di vista molecolare, può contenere quantità di DNA più elevate della maggior parte dei plasmidi e il DNA può essere efficientemente impacchettato nelle particelle fagiche in vitro. Inoltre, può essere utilizzato per infettare opportune cellule ospiti (trasfezione), processo molto più efficiente della trasformazione. Il fago lambda ha una mappa genetica complessa ed un elevato numero di geni. La regione centrale del genoma di lambda non è essenziale e può essere sostituita con DNA esogeno.

Il fago lambda "wild-type" non è un vettore di clonaggio adeguato poiché possiede molti siti per enzimi di restrizione. Per superare questo inconveniente sono stati costruiti fagi lambda modificati utilizzabili per il clonaggio. In un gruppo di fagi lambda modificati, chiamati fagi "Charon' (Caronte), i siti di restrizione indesiderati sono stati rimossi attraverso mutazioni puntiformi, delezioni o sostituzioni. In questi derivati in cui è presente un solo sito di restrizione, il pezzo di DNA esogeno viene inserito, mentre nei derivati con due siti il DNA esogeno può sostituire parte del DNA del fago. Questo secondo tipo di vettore, denominato vettore di sostituzione, è particolarmente utile quando deve essere clonato un frammento di DNA di grosse dimensioni. Entrambi i vettori presentano mutazioni per sostituzione. Uno dei geni inseriti per sostituzione è quello della b-galattosidasi. Quando il vettore si replica in un ceppo di Escherichia coli incapace di utilizzare il lattosio (Lac-), la b-galattosidasi viene sintetizzata dal gene portato dal fago e la presenza di placche Lac+ (lattosio positive) può essere evidenziata in piastra mediante l'impiego di un indicatore che cambia colore in funzione dell'espressione o meno della b-galattosidasi. Se un gene esogeno viene inserito nel gene per la b-galattosidasi, il carattere Lac+ viene perso. In queste condizioni le placche Lac- possono essere facilmente identificate come placche bianche in mezzo ad una miriade di placche colorate.

YAC

I vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) si propagano in S. cerevisiae. Sono i vettori a capacità massima (> 1 Mb). Lo studio dei cromosomi naturali ha dimostrato che per la propagazione del DNA sono indispensabili le regioni:

• Centromero (CEN)

• Telomeri (TEL)

• Origine/i di replicazione del DNA (ARS)

Oltre a ciò, gli YAC portano marcatori genetici selezionabili. Anche le sequenze portate dagli YAC sono instabili, ma per motivi diversi dai cosmidi. Spesso due o più YAC diversi si trovano nella stessa cellula, perché la trasformazione del lievito non esclude questo evento. La ricombinazione avviene tra sequenze simili di inserti diversi, spesso in regioni con sequenze ripetute. Si stima che circa il 40% dei cloni nelle librerie di YAC siano chimere di questo tipo. Questo crea ovvi problemi di ricostruzione della sequenza originale.

BAC

I vettori BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) ospitano inserti di lunghezza media di circa 120 Kb (massimo 300 Kb). Caratteristiche del vettore pBeloBACII

• Resistenza al cloramfenicolo (Cmr)

• Funzioni di ripartizione del fattore F (parA, parB, oriS), che assicurano la ripartizione dei BAC tra le cellule figlie.

• Gene lacZ’, con siti di restrizione adeguati per clonare lunghi inserti di DNA (es. NotI)

• Siti per il recupero delle sequenze clonate (loxP, cosN)

Retrovirus

Vengono utilizzati per trasfettare cellule eucariote

I vettori retrovirali sono quasi sempre difettivi nella replicazione. Gli elementi richiesti per il processo replicativo e per l’impacchettamento sono:

le LTR, necessarie per l’integrazione, la trascrizione e la poliadenilazionedell’RNA

la sequenza di impacchettamento Ψ

i siti di legame per i primer necessari per la replicazione del virus

Il vettore virale contenente queste tre sequenze, il gene esogeno e il marcatore di selezione viene trasfettato in una linea cellulare. I virus così prodotti vengono utilizzati per infettare le cellule bersaglio dove il genoma virale ricombinante si integrerà e il gene esogeno potrà essere espresso.

Altri virus usati sono:

Repliconi di SV40 (espressione transiente)
Repliconi del virus del papilloma bovino (BPV) (espressione stabile)
Repliconi del virus di Epstein-Barr (EBV) (espressione stabile)

Adenovirus
Virus adenoassociati (AAV)
Herpes virus
Retrovirus